苦瓜 MSAP 反应体系的优化及其种质资源表观遗传多样性

       摘 要 为研究苦瓜表观遗传多样性，通过正交设计方法优化了 MSAP 技术中预扩增和选择性扩增系统的 关键因素，构建了适用于苦瓜的 MSAP 反应体系，并利用其对 52 份苦瓜种质资源的表观遗传多样性进行分 析。 结果表明： 30 μ L MSAP 双酶切反应体系中，加入 E co R Ⅰ和 M spⅠ /HpaⅡ 各 10 U ，于 37 ℃水 浴酶切 4 h 时使酶切完全；最佳预扩增反应体系 20 μ L ，包含连接产物 4 μ L ， 10 × PCR buffer 2.0 μ L (25 mmol/L) ， d NTPs 0.3 μ L (2.5 mmol/ μ L) ， Taq 酶 0.1 μ L (5 U/ μ L) ， 10 mmol/ L 上下游引物各 1.0 μ L ；最佳选择性扩增反应体系 20 μ L ，包含 4 μ L 稀释 150 倍的预扩增产物。从 110 对引物中选出扩增效果好，条带清晰的 12 对引物组合 利用最佳反应体系对 52 份苦瓜种质资源进行 MSAP 扩增，共得到 430 条条带，其中多态性条带 218 条，多 态性比率为 50.70% 。对 DNA 甲基化模式进行分析，其中类型Ⅰ( 非甲基化类型 ) 3109 条，类型Ⅱ( 半甲基化 类型 ) 633 条，类型Ⅲ ( 全甲基化类型 ) 606 条，类型Ⅳ( 外部甲基化 ) 1250 条，苦瓜甲基化模式主要为外部甲基 化为主。Nei's 基因多样性指数和 Shannon 信息指数分别为 0.226 5 、 0.372 6 ，该结果表明试验中所用的苦瓜种 质资源具有丰富的遗传多样性，遗传变异和进化水平较高。UPGMA 聚类分析结果表明 12 个不同地区苦瓜 种质资源在相似性系数 0.88 处可分为 4 大类，大部分种质被聚集在第 1 类中，又可以分为 5 个亚群，亚群 Ⅰ：中国海南、 中国广东、 中国福建和日本；亚群Ⅱ：中国云南；亚群Ⅲ：泰国和格林纳达；亚群Ⅳ：中国北京；亚 群Ⅴ：中国台湾。 本研究通过利用正交优化建立 MSAP 反应体系，并对苦瓜种质资源甲基化表观遗传多样性 进行研究，这种基因组结构水平上的研究将为苦瓜种质资源的种群分化及物种进化的进一步研究提供依据。